神經領域實驗相關問題
A.答(dá)案
轉基因動物(wù)依賴的基因重組能(néng)夠實現高效且特意的基因重組，但由于轉基因動物(wù)難易獲得、動物(wù)交配需要大量耗時（至少2代交配才能(néng)獲得基因敲除動物(wù)）且區(qū)域或組織特異性不高（僅依賴啓動子調控）。
A.答(dá)案
（1）有(yǒu)效注射範圍：HRP的注射範圍從注射中(zhōng)心向周圍擴散，濃度遞減。其注射區(qū)的有(yǒu)效範圍是難以确定的問題，故影響對結果的分(fēn)析。一般認為(wèi)注射中(zhōng)心深染而不能(néng)辯明其結構的區(qū)域為(wèi)有(yǒu)效區(qū)，而其周圍可(kě)辨标記細胞的區(qū)域則為(wèi)無效區(qū)。
（2）過路纖維問題：路經注射區(qū)的纖維也可(kě)攝取HRP并被順、逆向運送。因此，标記部位所出現的神經元或終末，可(kě)能(néng)并非起于或終止于注射部位。這是在分(fēn)析結果時經常遇到的問題。
（3）側支标記：HRP标記被一軸突末梢攝入後，在其被逆向運送過程中(zhōng)，有(yǒu)一些可(kě)以沿該軸突的側支被順向運至側支的末梢，在側支的末梢部造成終末标記。因此，在一個部位發現終末标記，并不一定說明發出這些纖維的胞體(tǐ)位于注射區(qū)内。
（4）跨突觸标記：HRP被運至末梢後，可(kě)能(néng)被釋放出來，并被下一級神經元攝入，甚至再運送至下一級神經元的末梢。這種現象不多(duō)見，主要見于用(yòng)較靈敏的WGA- HRP作(zuò)追蹤劑時，而且是在第一級末梢密集，并與第二級神經元的關系密切的情況下出現。例如，視網膜節細胞末梢内的HRP可(kě)能(néng)跨突觸地标記外側膝狀體(tǐ)神經元。
A.答(dá)案
（1）神經元以外的其它細胞：在注射部位及其附近的膠質(zhì)細胞、血管内皮細胞、周細胞、巨噬細胞等可(kě)攝入HRP，經反應而着色。這對追蹤遠(yuǎn)距離纖維聯系的影響較小(xiǎo)，但對短距離聯系的研究卻有(yǒu)妨礙。一般根據其細胞形狀，尤其是核的形态及其與血管腔的關系等，易于與神經細胞區(qū)别，而且這些細胞中(zhōng)的反應顆粒常較粗大而大小(xiǎo)不均，胞漿也常均勻着色。但有(yǒu)時也可(kě)造成鑒别困難，尤其是隻有(yǒu)單個細胞時。
（2）神經元的内源性物(wù)質(zhì)：有(yǒu)的神經元含有(yǒu)脂褐素，随年齡之增長(cháng)而增多(duō)，可(kě)能(néng)與DAB反應顆粒混淆，在用(yòng)焦油紫複染的切片上，其暗視野效應還可(kě)能(néng)加強。在鼠、猴發現某些神經元内可(kě)能(néng)含有(yǒu)某種内源性酶或其它物(wù)質(zhì)，也可(kě)與DAB-H2O2起反應，産(chǎn)生棕色反應物(wù)。黑色素或其前身也有(yǒu)類似反應。這些物(wù)質(zhì)都可(kě)能(néng)成為(wèi)僞象的來源。因此，對此法之結果的評定應持慎重态度。
A.答(dá)案
（1）路徑選擇：熒光素也可(kě)用(yòng)于順行示蹤，但标記較弱，因此不推薦。
（2）标記方法：不同熒光素具(jù)有(yǒu)不同激發波長(cháng)和發射波長(cháng)，故可(kě)使用(yòng)雙标或多(duō)重标記的方法進行标記。但不同熒光素逆行運輸速度差别較大，實驗時可(kě)分(fēn)兩次手術注入熒光素。
（3）擴散問題：有(yǒu)些熒光素在到達胞體(tǐ)後有(yǒu)擴散出神經元胞體(tǐ)而染出其周圍神經膠質(zhì)細胞的傾向，因此适當存活時間的選擇很(hěn)重要。
（4）有(yǒu)效注射部位：由于熒光素分(fēn)子量較小(xiǎo)，逆行示蹤更易擴散，故比HRP法更難确定有(yǒu)效注射部位。同時也存在存在過路纖維攝入問題，分(fēn)析結果時需要額外注意。
（5）褪色問題：熒光素在激發光照射下較快褪色，因此允許觀察的時間短。即使在低溫、避光條件下，切片保存時間仍有(yǒu)限，不能(néng)長(cháng)期保存。
（6）優化方法：在50 %甘油和50 %的PBS混合液配制的封片劑中(zhōng)加入2.5%三乙烯二胺（triethylene diamine）可(kě)有(yǒu)效地延長(cháng)觀察和保存時間。也可(kě)将熒光素包裹在乳膠微球内作(zuò)追蹤劑，減弱擴散、過路纖維和褪色較快的問題。
A.答(dá)案
誘導型 Cre-loxP 系統介導了時間特異性基因敲除，通過對給予誘導劑的時間的控制，人為(wèi)操控基因敲除的發生。
（1）四環素誘導型 tetO-Cre
将四環素調控系統與Cre-loxP系統相結合，一般需要兩種轉基因小(xiǎo)鼠交配使用(yòng)，即 Cre 工(gōng)具(jù)鼠和rtTA或 tTA小(xiǎo)鼠。
在此過程中(zhōng)，具(jù)有(yǒu)轉錄激活功能(néng)的rtTA或者tTA與tetO結合後激活Cre的表達。同時，這種結合受四環素或四環素衍生物(wù)強力黴素（Dox）的調節，因此在 tetO-Cre 與組織特異性 rtTA （或 tTA ）雙轉基因陽性小(xiǎo)鼠中(zhōng)，可(kě)以通過給予或撤離 Dox 來控制 Cre 重組酶在特定組織中(zhōng)産(chǎn)生的時間。
（2）幹擾素誘導型 Mx1-Cre
幹擾素誘導是通過 Mx1 基因啓動子對于幹擾素的響應來實現的。此方法僅限于響應幹擾素的細胞，且其基因敲除效率依賴于組織或細胞對幹擾素的響應水平或幹擾素響應細胞的數量。
（3）雌激素誘導型 Cre-ER
将雌激素受體(tǐ)（ER）的配體(tǐ)結合區(qū)與 Cre 重組酶相融合，形成定位于胞漿中(zhōng)的融合蛋白（Cre-ER）。這樣就通過控制雌激素的注射時間，可(kě)以實現對基因重組時間特異性的調控。為(wèi)了避免内源雌激素的幹擾，在人ER的配體(tǐ)結合區(qū)進行一個點突變（G521R），使 Cre-ER 隻響應外源的人工(gōng)合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT）的誘導。
A.答(dá)案
剌激頻率和強度和病毒沒有(yǒu)關系，是研究的問題決定的，一般剌激胞體(tǐ)強度5-10 mW，軸突10-l5 mW ，頻率和剌激的細胞特性有(yǒu)關， 5-60 hz不等。
