關于免疫熒光實驗的幾個問題
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做間接法免疫熒光染色，要怎麽設置對照？
參考見解：最好是同一視野在未用(yòng)熒光激發下進行對照，看是否非特異性染色。
（1）空白對照：如果你作(zuò)的是石蠟切片的免疫組化，這一個對照必須有(yǒu)，目的是看自發熒光。脫蠟後直接在熒光顯微鏡下觀察。
（2）陰性對照：标本直接滴加二抗，呈陰性反應。
（3）抗原對照：标本加同種動物(wù)的未免疫血清，以PBS沖洗後，在加抗免疫球蛋白熒光抗體(tǐ)。因未免疫動物(wù)的血清中(zhōng)無特異性抗體(tǐ)，應呈陰性反應。
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免疫熒光：用(yòng)免疫熒光方法做同樣的内容，組織切片和培養細胞，兩者操作(zuò)過程中(zhōng)有(yǒu)哪些不同？
參考見解：隻是固定方法不同，細胞固定用(yòng)甲醇（多(duō)聚甲醛、戊二醛混合液均可(kě)），切片固定用(yòng)多(duō)聚甲醛，而染色方法是一樣的。
（1）你的二抗是用(yòng)FITC标記的，為(wèi)避免熒光分(fēn)解，分(fēn)裝(zhuāng)及熒光顯微鏡觀察時均要避光。
（2）封片最好用(yòng)甘油加0。5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液，後者能(néng)使玻片透明更亮。
（3）關于免疫酶染色，如果是用(yòng)過氧化物(wù)酶做标記，就必須用(yòng)3%H2O2以去除内緣性過氧化物(wù)酶。
（4）如果要做蘇木(mù)素複染，可(kě)用(yòng)鹽酸溶液去除蘇木(mù)素。
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免疫熒光雙标技(jì )術的注意事項
（1）選取primary antibodies時要來源于兩種不同的動物(wù)，參考來源于rabbit和rat的抗體(tǐ)，secondary antibodies則是不同熒光信号标記的，參考donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。
（2）兩種primary antibodies同時孵育，然後兩種secondary antibodies同時孵育。抗體(tǐ)濃度、孵育時間要認真摸索， primary antibodies 4度孵育過夜比較好，背景比較幹淨。
（3）陽性對照采用(yòng)的是陽性組織切片，陰性對照則分(fēn)别是rabitt和rat的IgG，熒光标記物(wù)對照是PBS+熒光标記物(wù)。
（4）Block用(yòng)的血清使secondary antibody來源動物(wù)的血清，
（5）其餘同一般操作(zuò)。
