免疫熒光染色-間接法
原理(lǐ)：基本原理(lǐ)是先用(yòng)特異性抗體(tǐ)與細胞内相應抗原結合，再用(yòng)熒光素标記的二抗與特異性抗體(tǐ)相結合，形成抗原-特異性抗體(tǐ)-标記熒光抗體(tǐ)的複合物(wù)。因為(wèi)在複合物(wù)上帶有(yǒu)比直接法更多(duō)的熒光标記物(wù)，所以比直接法更靈敏。
方法一：用(yòng)NGS封閉
PBS洗一次；
加入固定液（固定液：0.1%戊二醛+3%多(duō)聚甲醛 in PBS），固定10min；
加入0.1% NaBH4 ，7min；并從此步開始搖勻；
PBS洗3次，5min/次；
加入破膜液（破膜液：0.2% triton in PBS），15min；
加入封閉液（0.05% triton+10% NGS in PBS），90min；
加入一抗，60min；一抗使用(yòng)抗體(tǐ)稀釋液稀釋200倍/500倍（抗體(tǐ)稀釋液：0.05% triton+5% NGS in PBS）；
Washing buffer（0.05% triton+1% NGS in PBS）洗5次，15min/次；
加入二抗，30min；使用(yòng)抗體(tǐ)稀釋液将二抗稀釋500倍/1000倍；
Washing buffer 洗5次，15min/次；
PBS 洗1次，5min；
如需要做STORM則需要進行二次固定，停止搖勻；
加入固定液，10min；
PBS洗3次，5min/次；
H2O洗2次，5min/次。
方法二：用(yòng)BSA封閉
1. 将培養基洗淨：PBS快洗一次，然後慢洗3次，5min/次；
2. 固定細胞：4%多(duō)聚甲醛固定15min；（4% PFA配置：8g多(duō)聚甲醛，8g蔗糖，溶于200 ul PBS）
3. 同1；
4. 破膜液破膜45min（破膜液：用(yòng)6% BSA将20% triton稀釋80倍）；
5. 加入一抗，1h（6% BSA 将抗體(tǐ)稀釋100倍）；
6. PBS快洗1次，慢洗3次，10min/次；
7. 加入二抗，1h（6% BSA 将抗體(tǐ)稀釋100倍）；
8. 同6；
免疫染色實驗可(kě)能(néng)會遇到的問題
樣品染色結果信号弱或者無信号：
原因：
1）細胞或組織樣本保存時間過長(cháng)；
2）抗體(tǐ)濃度偏低，參照抗體(tǐ)說明書，再根據樣本表達量進行摸索；
3）一抗孵育時間太短，加長(cháng)孵育時間，或者建議4℃ 過夜孵育。
染色結果背景偏高：
原因：
1）封閉不充分(fēn)；加長(cháng)封閉時間（注意，封閉需要在搖床上搖勻）
2）抗體(tǐ)濃度過高；參照抗體(tǐ)說明書，再根據樣本表達量進行摸索；
3）抗體(tǐ)孵育時間過長(cháng)或溫度過高；
4）清洗不充分(fēn)；可(kě)适量多(duō)清洗幾次
5）樣本變幹，染色過程确保樣品始終浸沒于液體(tǐ)環境中(zhōng)
非特異性染色較多(duō)：
原因：
）固定液殘留，這裏需要縮短固定時間或者在封閉液中(zhōng)加甘氨酸，做抗原修複也可(kě)以幫助解決非特異性染色；
多(duō)輪标記：
在多(duō)輪标記實驗中(zhōng)，要注意抗體(tǐ)種屬的問題，兩種一抗種屬不同或者雖然種屬相同但抗體(tǐ)亞型不同，可(kě)以一起染，二抗也是，需要用(yòng)與一抗對應的種屬及亞型。
