免疫熒光技(jì )術——直接法

染色步驟繁瑣，因此每一步都很(hěn)關鍵。在實驗中(zhōng)常出現的問題及解決方法如下。

進行免疫組織化學(xué)染色時，必須證明組織内顯示陽性産(chǎn)物(wù)确實是抗原與相應抗體(tǐ)特異性結合所産(chǎn)生的。避免假陰性或假陽性造成的困擾，要嚴格對照實驗才能(néng)對實驗結果做出正确評價。

掉片是染色過程中(zhōng)常遇到的問題之一。解決方法：

① 使用(yòng)經多(duō)聚賴氨酸或APES包被過載片，黏附效果最好，但價格相對昂貴；

② 也可(kě)用(yòng)經1%明膠包被的載玻片貼片；

③ 貼有(yǒu)切片的載片從-20℃拿(ná)出時，可(kě)先在4℃放置30min,後再放于室溫充分(fēn)晾幹，避免切片因過快變熱而掉片；

④對石蠟切片進行抗原修複時，應避免修複液幹涸，切片暴露在外，需等修複液徹底降溫後，再将切片拿(ná)出漂洗，禁忌驟熱驟冷引起切片收縮掉片。

關于抗體(tǐ)涉及以下幾個方面：

①種屬在進行雙重免疫标記時，要選擇來源于兩種不同種屬動物(wù)的一抗，如選擇來源于rabbit和mouse的抗體(tǐ)，二抗則用(yòng)帶有(yǒu)不同熒光素标記的，如抗rabbit或抗mouse二抗， FITC和Tex-Red;

②孵育時間和溫度兩種一抗可(kě)以同時孵育，然後加入相對應的抗－抗的二抗進行孵育，一抗孵育時間室溫至少需要16h,二抗孵育室溫不宜超過4h,選擇4℃孵育比較好，背景比較清晰，另外孵育時夏天特别注意室溫溫度；

③抗體(tǐ)稀釋液通常第一抗體(tǐ)選擇1%牛血清白蛋白進行稀釋，第二抗體(tǐ)選擇用(yòng)0.01mol/LPBS稀釋。

免疫組織化學(xué)染色中(zhōng)的非特異性的問題，是決定結果好壞的關鍵問題，其核心問題是交叉反應。選擇特異性強、親和力高、稀釋度高的第一抗體(tǐ)是避免非特異染色最有(yǒu)效的方法。實驗中(zhōng)常用(yòng)到的抗體(tǐ)主要是單克隆抗體(tǐ)和多(duō)克隆抗體(tǐ)。單抗是針對單－抗原決定簇制備的抗體(tǐ)，具(jù)有(yǒu)特異性強、重複性好等優點，但在提純過程中(zhōng)易變性，穩定性差；多(duō)抗是将純化的抗原直接免疫動物(wù)後，從動物(wù)血中(zhōng)獲得的免疫血清，其可(kě)以識别多(duō)個抗原表位，因此特異性相對較低、易産(chǎn)生抗體(tǐ)的交叉反應、重複性差、每批次都有(yǒu)可(kě)能(néng)不同。在實際工(gōng)作(zuò)中(zhōng)，可(kě)根據具(jù)體(tǐ)需要以及參考文(wén)獻的報道選擇合适的抗體(tǐ)。

其他(tā)原因及解決辦(bàn)法如下：

(1)抗原間的交叉反應主要是标本固定不當或組織抗原封閉不全。每個抗原有(yǒu)不同的抗原決定簇，也可(kě)能(néng)有(yǒu)類似的抗原決定簇。因此可(kě)以選擇結構相近的抗原做抗體(tǐ)吸收實驗以避免抗原間的交叉反應。

(2)抗體(tǐ)與抗原除待檢測的抗原外，組織中(zhōng)還可(kě)能(néng)存在類屬抗原，也可(kě)與相應抗體(tǐ)結合。通常用(yòng)2%-5%牛血清白蛋白或二抗來源的動物(wù)血清進行封閉。

(3)二抗第二抗體(tǐ)産(chǎn)生的非特異性主要是非IgG蛋白或非特異的IgG蛋白之間，通過特異性反應或通過非特異的疏水鍵與組織或細胞結合，産(chǎn)生非特異性染色。處理(lǐ)方法同上。

(4)熒光性非特異組織有(yǒu)自發熒光；部分(fēn)遊離熒光素殘留在二抗中(zhōng)，未與抗體(tǐ)蛋白質(zhì)結合；抗體(tǐ)分(fēn)子上标記的熒光素分(fēn)子太多(duō)，這種過量标記的抗體(tǐ)分(fēn)子帶了過多(duō)的陰離子，可(kě)吸附于正常組織上而呈現非特異性染色。解決辦(bàn)法可(kě)以通過對照實驗或PBS代替進行鑒别和排除。注意選擇特異性強、質(zhì)量好、純度高的熒光二抗。

(5)内源性過氧化物(wù)酶若标本因灌流固定不當，可(kě)能(néng)存在紅細胞和粒細胞中(zhōng)的内源性過氧化物(wù)酶。可(kě)以通過甲醇-H202處理(lǐ)切片，避免DAB反應形成非特異染色。

片子着色不均勻現象，主要是：

①石蠟切片染色，脫蠟不充分(fēn)，可(kě)以先在60℃烤箱烤1h;

②脫水不徹底，需配置新(xīn)鮮的梯度酒精(jīng)；

③貼片孵育抗體(tǐ)時抗體(tǐ)覆蓋不均勻，切片傾斜，抗體(tǐ)流失等原因，需平放切片，切片擦幹後再加抗體(tǐ)，也可(kě)以用(yòng)免疫組化筆(bǐ)（在載玻片上的有(yǒu)組織的邊緣畫圓，防止抗體(tǐ)外溢），既節約抗體(tǐ)又(yòu)避免抗體(tǐ)流失；

④冰凍切片漂染，每組切片不宜太多(duō)，否則互相重疊，導緻接觸抗體(tǐ)不均勻。

切片染色背景太深，不易區(qū)分(fēn)特異性與非特異性着色。這主要是：

①抗體(tǐ)孵育時間過長(cháng)或抗體(tǐ)濃度過高；

②抗體(tǐ)質(zhì)量差或變質(zhì)；

③DAB濃度過高，顯色時間過長(cháng)，或反應時溫度過高；

④ PBS沖洗不充分(fēn)，殘留抗體(tǐ)增強着色；

⑤ 切片染色過程中(zhōng)出現幹片，而導緻非特異性着色增強；

⑥切片在緩沖液或修複液中(zhōng)浸泡時間太久（大于24h),不可(kě)室溫長(cháng)時間放置。

石蠟切片抗原修複方法很(hěn)多(duō)，從弱到強有(yǒu)胰酶修複、微波修複、高壓修複。修複液也分(fēn)若幹種，如pH6.0袧橡酸鈉修複液、pH8.0的乙二氨四乙酸二鈉(EDTA)修複液、pH9.0的EDTA-Tris修複液等，修複時間也根據标本、抗原、抗體(tǐ)等選擇。

各個步驟之間的漂洗非常重要，可(kě)以防止一抗、二抗殘留試劑引起的非特異着色。如果染色抗體(tǐ)種類較多(duō)，切片組别較多(duō)時不僅漂洗時間要足夠，而且還可(kě)以單獨漂洗，防止抗體(tǐ)之間的交叉污染。