細胞實驗常見問題（一）
A.答(dá)案
1）轉染試劑
不同細胞系轉染效率通常不同，但細胞系的選擇通常是根據實驗的需要，因此在轉染實驗前應根據實驗要求和細胞特性選擇适合的轉染試劑。
2）細胞生長(cháng)狀态
一般低的細胞代數（<50）能(néng)确保基因型不變。最适合轉染的細胞是經過幾次傳代後達到指數生長(cháng)期的細胞，細胞生長(cháng)旺盛，最容易轉染。
3）轉染方法
因不同實驗室培養的細胞性質(zhì)不同，質(zhì)粒定量差異，操作(zuò)手法上的差異等，其轉染效果可(kě)能(néng)不同，應根據實驗室的具(jù)體(tǐ)條件來确定最佳轉染條件。
4）載體(tǐ)結構
轉染載體(tǐ)的構建（病毒載體(tǐ)，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR産(chǎn)物(wù)，寡核苷酸等）影響轉染結果。除載體(tǐ)構建外，載體(tǐ)的形态及大小(xiǎo)對轉染效率也有(yǒu)不同的影響。
A.答(dá)案
1）增強劑用(yòng)量過大，可(kě)适當減少其用(yòng)量；
2）病毒量過大，可(kě)适當減少病毒用(yòng)量，可(kě)采用(yòng)更換培養基或增加培養基量的方法。
A.答(dá)案
1）根據細胞增殖速度決定接種量，一般需保證感染後4天左右細胞剛好快長(cháng)滿培養皿底部。
2）對于大部分(fēn)細胞系：傳代周期2-3天，感染時細胞鋪闆密度保持在20%-30%範圍内。
3）對于某些原代細胞：細胞生長(cháng)緩慢，接種時彙合度可(kě)提升至50%-60%，保證感染後4天左右細胞彙合度達到90%-100%。
4）對于非分(fēn)裂細胞：接種後不再增殖（如神經元細胞），按照彙合度100%進行接種。
A.答(dá)案
一般是病毒對細胞具(jù)有(yǒu)一定毒性，可(kě)調整、降低感染MOI值。并密切關注細胞狀态，在感染後4、8、12小(xiǎo)時定時觀察細胞情況。若出現細胞狀态變差情況，立即對細胞進行換液處理(lǐ)，使用(yòng)新(xīn)鮮的完全培養液替換病毒感染培養液。
A.答(dá)案
病毒感染效率受多(duō)個因素影響，包括細胞自身生長(cháng)狀态、細胞數量、細胞被感染的難易程度等。因此在實驗過程中(zhōng)，保證細胞正常增殖、輪廓清晰，同時保持合适的細胞密度，選擇最佳感染條件可(kě)更好保證感染效率。
對于懸浮細胞，可(kě)采用(yòng)離心感染的方法，減少病毒感染時的體(tǐ)積，從而提高感染效率。如培養闆密封，可(kě)用(yòng)平角轉子離心機1000 g離心1 hrs，再放回培養箱中(zhōng)繼續正常培養。
A.答(dá)案
GFP病毒感染細胞後，細胞熒光強度取決于病毒進入細胞顆粒數、細胞本身的增殖狀态、細胞類型、觀察時間、GFP基因啓動子活性等因素。因此，目的細胞感染病毒顆粒數越多(duō)、細胞增殖越快，GFP熒光會較強。
其次，病毒在增殖較快的細胞中(zhōng)感染96-120 hrs後，GFP蛋白表達才達到峰值；在增殖較慢的細胞中(zhōng)，這一時間更長(cháng)。
此外，強啓動子後的GFP基因熒光表達強，反之，弱啓動子後面的熒光表達較弱。
A.答(dá)案
若電(diàn)轉效果不佳，可(kě)考慮一下條件進行優化：
1. 電(diàn)場參數
不同細胞系具(jù)有(yǒu)不同的最佳場強值，其确定方法除了實驗直接測定比較不同場強下轉染率的高低外，還可(kě)以采取較為(wèi)簡便的間接法。文(wén)獻顯示存活率在50%左右的電(diàn)場參數為(wèi)理(lǐ)想參數，故可(kě)間接測定存活率來确定最佳場強值。
2. 脈沖過程
①脈沖波形主要分(fēn)為(wèi)兩種，方波脈沖和指數遞減波脈沖。一般哺乳動物(wù)細胞電(diàn)轉選擇方波脈沖，細菌、酵母菌、昆蟲細胞選擇指數遞減波脈沖。
②脈沖時間的選定主要取決與脈沖波形。在方波脈沖中(zhōng)，脈沖時間可(kě)直接設定。在指數遞減波脈沖中(zhōng)，脈沖時間是指電(diàn)壓衰減至初始電(diàn)壓1/3時所用(yòng)的時間，等于電(diàn)容（C）與電(diàn)阻（R）的乘積，單位是ms。在參數優化中(zhōng)，增加電(diàn)壓應當降低脈沖時間，而減小(xiǎo)電(diàn)壓則應當增大脈沖時間。
③一般而言，對于大多(duō)數細胞類型都選擇單次脈沖。而在有(yǒu)些情況下可(kě)能(néng)會用(yòng)到多(duō)次脈沖，因為(wèi)低電(diàn)壓、短脈沖時間、多(duō)次脈沖可(kě)有(yǒu)效避免細胞損傷。多(duō)次脈沖建議中(zhōng)間間隔1min。
3. 細胞因素
用(yòng)于電(diàn)轉的細胞一般選取處于對數生長(cháng)期的細胞（15代以内，傳代後2d）。細胞懸液濃度一般為(wèi)1*106/ml，當細胞生長(cháng)密度大于3*106/ml，轉染效率會下降。
4. 質(zhì)粒因素
從質(zhì)粒濃度看，細胞密度為(wèi)1*106/ml，DNA用(yòng)量在2-5 μg/ml轉染效率最高。
5. 溫度
一般情況下，電(diàn)轉的過程是在室溫下進行，但在電(diàn)擊前後需對細胞進行冰浴處理(lǐ)。
6. 電(diàn)轉後培養液的選擇
細胞在電(diàn)擊後十分(fēn)脆弱，其培養液的選擇應注重提高細胞的存活率，一般選擇 低滲的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可(kě)參考加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO。
A.答(dá)案
siRNA導入細胞有(yǒu)以下幾種方法：化學(xué)轉染技(jì )術、電(diàn)穿孔法、磷酸鈣共沉澱技(jì )術、顯微注射和載體(tǐ)導入技(jì )術。選擇時應該依據實驗條件考慮以下因素：細胞對轉入方式的承受能(néng)力、細胞對病毒侵染的易感性、細胞的生長(cháng)特性等。對貼壁細胞來說化學(xué)轉染技(jì )術是最為(wèi)常用(yòng)的方法，而對懸浮細胞則采用(yòng)電(diàn)穿孔法效果較好。
A.答(dá)案
一般根據課題研究要求進行，如果單純檢測轉染效率，推薦用(yòng)qRT-PCR方法和luciferase方法。還可(kě)根據研究，采用(yòng)組織學(xué)和生理(lǐ)學(xué)，以及物(wù)理(lǐ)測量的方法進行。由于體(tǐ)内轉染的複雜性，通常體(tǐ)外試驗中(zhōng)常采用(yòng)的轉染GFP蛋白用(yòng)熒光顯微鏡觀察的方法，由于體(tǐ)内取出的組織材料背景高，檢測較為(wèi)困難。
A.答(dá)案
1）RNA與轉染試劑比例不佳
由于RNA序列差異、合成條件不同以及是否帶有(yǒu)熒光等标記，決定了RNA和轉染試劑在不同情況下會有(yǒu)不同的最佳條件，建議先進行預實驗優化。
2）細胞密度不佳
調整細胞密度到轉染時彙合度為(wèi)20-40%。成功轉染siRNA的細胞會産(chǎn)生目标基因表達下調，但未成功轉染的細胞卻不受影響，這時轉染效率和總的細胞數量就很(hěn)重要，一般細胞數量較少時轉染效率高。由于siRNA沉默時效性的影響，轉染後48小(xiǎo)時才能(néng)進行進行qRT-PCR檢測，轉染後48-72小(xiǎo)時才能(néng)進行蛋白檢測。如果轉染時鋪闆密度較高，細胞一方面轉染效果不理(lǐ)想，直接影響沉默效果和數據可(kě)靠性，另一方面，48小(xiǎo)時甚至更長(cháng)時間後，沉默檢測最佳點時，過于密集的細胞将影響細胞狀态，從而影響實驗結果。
3）RNA效率不高
選擇最優RNA，并采用(yòng)已知高效的RNA做對照。siRNA的合成需要注意的是一定要選用(yòng)高純度的siRNA，siRNA的純度直接關系到轉染效率和沉默效率。
