五分(fēn)鍾了解//自噬LC3雙标腺病毒
A: 自噬是細胞内的一種“自食（Self-eating）”的現象，凋亡是“自殺（Self-killing）”的現象，二者共用(yòng)相同的刺激因素和調節蛋白，但是誘發阈值和門檻不同，如何轉換和協調目前還不清楚. 自噬是指膜（目前來源還有(yǒu)争議，大部分(fēn)表現為(wèi)雙層膜，有(yǒu)時多(duō)層或單層）包裹部分(fēn)胞質(zhì)和細胞内需降解的細胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體(tǐ)（autophagosome），最後與溶酶體(tǐ)融合形成自噬溶酶體(tǐ)（autophagolysosome），降解其所包裹的内容物(wù)，以實現細胞穩态和細胞器的更新(xīn)。
目前根據發生過程分(fēn)為(wèi)三類：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。
細胞的整個區(qū)域被包圍在雙膜小(xiǎo)泡的自噬體(tǐ)中(zhōng)，這些自噬體(tǐ)然後與溶酶體(tǐ)融合成為(wèi)自噬溶酶體(tǐ)，其内容物(wù)随後被其中(zhōng)的蛋白酶降解。即我們說的自噬（autophagy）
是指溶酶體(tǐ)主動、直接吞噬胞漿成分(fēn)的一種方式。
一些分(fēn)子伴侶，如hsp70，能(néng)幫助未折疊蛋白轉位入溶酶體(tǐ)。通常說的自噬泛指Macroautophagy。
步驟1：細胞接受自噬誘導信号後，在胞漿的某處形成一個小(xiǎo)的類似“脂質(zhì)體(tǐ)”樣的膜結構，然後不斷擴張，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一個由2層脂雙層組成的碗，可(kě)在電(diàn)鏡下觀察到，被稱為(wèi)Phagophore，是自噬發生的鐵證之一。
步驟2：Phagophore不斷延伸，将胞漿中(zhōng)的任何成分(fēn)，包括細胞器，全部攬入“碗”中(zhōng)，然後“收口”，成為(wèi)密閉的球狀的autophagosome，我把它翻譯為(wèi)“自噬體(tǐ)”。電(diàn)鏡下觀察到自噬體(tǐ)是自噬發生的鐵證之二。有(yǒu)2個特征：一是雙層膜，二是内含胞漿成分(fēn)，如線(xiàn)粒體(tǐ)、内質(zhì)網碎片等。
步驟3：自噬體(tǐ)形成後，可(kě)與細胞内吞的吞噬泡、吞飲泡和内體(tǐ)融合（這種情況不是必然要發生的）。
步驟4：自噬體(tǐ)與溶酶體(tǐ)融合形成autolysosome，期間自噬體(tǐ)的内膜被溶酶體(tǐ)酶降解，2者的内容物(wù)合為(wèi)一體(tǐ)，自噬體(tǐ)中(zhōng)的“貨物(wù)”也被降解，産(chǎn)物(wù)（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中(zhōng)，供細胞重新(xīn)利用(yòng)，而殘渣或被排出細胞外或滞留在胞漿中(zhōng)。
正常培養的細胞自噬活性很(hěn)低，不适于觀察，因此，必須對自噬進行人工(gōng)幹預和調節，常用(yòng)的工(gōng)具(jù)藥有(yǒu)：
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞劑
3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）
除了選用(yòng)上述工(gōng)具(jù)藥外，一般還需結合遺傳學(xué)技(jì )術對自噬相關基因進行幹預：包括反義RNA幹擾技(jì )術（Knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等。
由于自噬體(tǐ)屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體(tǐ)需在透射電(diàn)鏡下。Phagophore的特征為(wèi)：新(xīn)月狀或杯狀，雙層或多(duō)層膜，有(yǒu)包繞胞漿成分(fēn)的趨勢。自噬體(tǐ)（AV1）的特征為(wèi)：雙層或多(duō)層膜的液泡狀結構，内含胞漿成分(fēn)，如線(xiàn)粒體(tǐ)、内質(zhì)網、核糖體(tǐ)等。自噬溶酶體(tǐ)（AV2）的特征為(wèi)：單層膜，胞漿成分(fēn)已降解。（autophagic vacuole，AV）
4) 利用(yòng)Western Blot檢測p62蛋白來評價自噬以及自噬流的強弱:
起初自噬所降解的底物(wù)被認為(wèi)是随機的,但是後來的研究表明有(yǒu)些蛋白是seletively降解的,在這些蛋白之中(zhōng)研究的最為(wèi)透徹的是蛋白p62,p62 is selectively incorporated into autophagosomes through direct binding to LC3 and is efficiently degraded by autophagy ; thus, the total cellular expression levels of p62 inversely correlate with autophagic activity. (一般情況下p62蛋白水平的多(duō)少與自噬流的強弱有(yǒu)着反比例關系)
聯系電(diàn)話：023-86185422
駱經理(lǐ)：17815392366
公(gōng)司官網：www.xuanzunbio.com
公(gōng)司地址：重慶市高新(xīn)區(qū)西永大道36号附4号A2092
