【神經示蹤】AAV等病毒在神經示蹤領域的應用(yòng)

點

擊

藍

字

- 關注我們-

大腦神經網絡是由數目龐大、形态各異的神經元通過突觸連接構成的複雜結構，是大腦行使認知、記憶、感覺、情緒等功能(néng)的結構基礎。揭示大腦神經網絡結構，是最終理(lǐ)解大腦處理(lǐ)多(duō)種信息相關機制的基本前提。由此，神經示蹤技(jì )術應運而生。

早在1873年，意大利科(kē)學(xué)家卡米洛·高爾基首創鉻酸鹽-硝酸染色法，将解剖所得組織中(zhōng)神經元和膠質(zhì)細胞的胞體(tǐ)與突起染成棕黑色，而未被染色的細胞呈無色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察、用(yòng)手繪圖片記錄。這是人類最早研究神經通路的形态和神經元間的相互聯系的技(jì )術。20世紀80年代，Kristenseson将HSV1注射到小(xiǎo)鼠排腸肌，發現他(tā)能(néng)通過坐(zuò)骨神經感染脊神經背根節及脊髓背角，而将HSV1注入兔眼時，病毒順行感染視網膜節細胞、中(zhōng)腦上丘與外側膝狀體(tǐ)。

近些年來，随着基因技(jì )術的發展和綠色熒光蛋白（GFP）基因的發現與應用(yòng)，加上一些新(xīn)的免疫學(xué)技(jì )術的出現和發展，病毒以其特有(yǒu)的優點在神經環路示蹤方面的應用(yòng)越來越廣泛。本文(wén)将對常用(yòng)的病毒以及染料在神經環路示蹤方面的應用(yòng)予以綜述。

神經元是具(jù)有(yǒu)極性的細胞,因此神經環路示蹤技(jì )術包括順行标記、逆行标記、跨突觸标記與非跨突觸标記等方面。

壹

逆行示蹤

如果要研究某個腦區(qū)是由哪個神經元來控制的，就需要反向追蹤。傳統的逆向示蹤方法有(yǒu)熒光染料标記、示蹤蛋白标記和辣根過氧化物(wù)酶（HRP）等。其中(zhōng)Fast blue，Fluorogold，霍亂，toxin b, 羰化青，retro beads等[1],HRP可(kě)以通過内吞途徑進入細胞内，經過一段時間後，取材，切片，染色，逆向标記神經元。

病毒方面，II型犬腺病毒CAV-2與新(xīn)血清型腺相關病毒rAAV2-retro可(kě)以通過軸突末端侵染神經元，從而使其載體(tǐ)通過包漿運輸在神經元胞體(tǐ)表達，結合熒光蛋白技(jì )術，進而實現逆向标記[2]。

貳順向示蹤

如果要研究某個腦區(qū)向哪個腦區(qū)進行對應的功能(néng)，就需要采用(yòng)順行追蹤的方法。傳統的順行示蹤方法有(yǒu)麥角凝集素（WGA）、大豆凝集素（PHA）、生物(wù)素葡糖胺（BDA）等。

病毒方面，直接在目标腦區(qū)注射帶有(yǒu)熒光蛋白載體(tǐ)的AAV，如AAV-hSyn-EYFP、AAV-DIO-ChR2-EYFP等等即可(kě)實現順向示蹤[5]。然而此種順向示蹤技(jì )術并不能(néng)排除路過某腦區(qū)而未形成突觸這一現象，需後續電(diàn)生理(lǐ)記錄驗證。

單純疱疹病毒（HSV、 VSV）和僞狂犬病毒（PRV）都能(néng)實現跨突觸的順行追蹤。2017年1月，美國(guó)南加州大學(xué)的李志(zhì)強教授團隊首次報道了一種高滴度的 AAV 1型病毒，它可(kě)以在神經突觸中(zhōng)進行順行示蹤，并在此基礎上實現了攜帶載體(tǐ)的表達。

結語：

示蹤是研究腦内神經環路的一種重要手段。本項目拟在前期工(gōng)作(zuò)的基礎上，通過基因工(gōng)程、病毒追蹤等手段，通過基因重組、添加特定篩查标志(zhì)、改變病毒感染特征等手段，實現對病毒株的定向改造，以及在基礎與臨床研究中(zhōng)的應用(yòng)，是今後病毒追蹤的重要發展方向。