CAV2逆行标記---在神經領域的應用(yòng)

為(wèi)了确定神經回路的輸入輸出組織，本研究自主開發了TRIO(示蹤輸入組織與輸出組織之間的關系)和cTRIO(特殊性細胞大熱TRIO)方法。

TRIO鑒别A區(qū)的神經細胞，A區(qū)的神經元與B神經元之間有(yǒu)一種突觸聯系，并向C區(qū)投射。A-B連接是狂犬病病毒（簡稱RVdG）通過反向跨突觸示蹤引起的，是狂犬病病毒（簡稱RVdG）感染引起的一種新(xīn)的神經退行性疾病。B區(qū)初始細胞可(kě)表達狂犬狂犬病毒糖蛋白（G）及TVA受體(tǐ)（TC），并于RVdG結合，使B區(qū)初始細胞與RVdG結合，使其能(néng)夠通過突觸傳遞至 A區(qū)前突觸神經元。

TRIO中(zhōng)TC、G基因的表達依賴于Cre，而B去則由AAV介導。Cre是一種重要的神經傳導蛋白，其功能(néng)主要是通過犬腺病毒2（簡稱CAV）介導。然而，TRIO無法分(fēn)辨B區(qū)的各種細胞。

在cTRIO，将Cre酶的B區(qū)特異的細胞中(zhōng)進行表達。在B區(qū)域，TC、G的表達依賴于CAV-FLEx-loxP-Flp重組酶的特異性C區(qū)域。因此，隻有(yǒu)能(néng)夠将Cre轉運至C區(qū)的B細胞才能(néng)作(zuò)為(wèi)RVdG跨突觸示蹤的初始細胞。

本研究采用(yòng)TRIO及cTRIO分(fēn)别對大鼠運動皮質(zhì)（MC）進行幹預。本項目拟通過體(tǐ)外培養和動物(wù)模型，将CAV-Cre注入MC，并用(yòng)AAV-ELEx-loxP-TC/CG注入MC。結果顯示了MC第2/3層（L2/3）\L5（圖1F，左側；L6為(wèi)初始細胞。）

cTRIO（cTRIO）将CAV-FLFxloxp-Flp注入Rbp4-Cre小(xiǎo)鼠的cMC和延髓（Me），靶向定位于皮質(zhì)内外的L5神經元。同時向MC内注入AAV-FLExFRT-T/G；這樣就會使初始細胞局限在MCL5（圖1F,中(zhōng)點和右邊)，正如Rbp4-Cre的表達模式所預測的那樣。

通過控制實驗，我們發現，在TRIO的CAV-Cre和cTRIO的CAV-FLFxloP-Flp、Rbp4-Cre中(zhōng)，狂犬病毒可(kě)以标記大部分(fēn)長(cháng)程傳入神經元。我們前期研究發現，與TRIO想比，cTRIO能(néng)将初始細胞限定在更多(duō)的亞群，且在皮層下及胼胝體(tǐ)向L5神經元同時接收來自丘腦或皮質(zhì)的信息。TRIO同時也發現在大鼠的胼胝體(tǐ)和紋狀體(tǐ)中(zhōng)，有(yǒu)一種與肥大細胞相關的前突觸伴侶。

此外，我們還發現，CAV的擴散具(jù)體(tǐ)位置多(duō)在200um内，而且也有(yǒu)可(kě)能(néng)感染軸索通路。

我們前期研究發現，CAV-Cre在Ai4小(xiǎo)鼠5個腦區(qū)分(fēn)别注入CAV-Cre，發現在上述腦區(qū)投射的神經細胞（部分(fēn)離注射點>1 cm）都得到了有(yǒu)效的标記。因而， CAV能(néng)夠遠(yuǎn)距離侵染多(duō)種神經纖維的軸突及末梢。

目前已經确定了5個腦區(qū)：嗅球、聽皮層、海馬、小(xiǎo)腦以及延髓，它們都能(néng)接收到藍斑核-去甲腎上腺素的投射。将CAV-Cre注入Ai14小(xiǎo)鼠後，發現藍斑核内 NE （NE）能(néng)神經元。

相比後腦投射的LC-NE神經元，前腦投射的LC-NE神經元更偏向背側。

本研究為(wèi)LC-NE神經元的突觸輸入了第一次全腦定量分(fēn)析。

這項研究提供的病毒基因工(gōng)具(jù)，也可(kě)用(yòng)于研究哺乳動物(wù)腦内其它環路，如運動皮質(zhì)。TRIO，尤其是 cTRIO，是對以往選擇性投射定位技(jì )術的拓展，使之可(kě)以應用(yòng)于中(zhōng)樞神經系統的複雜回路分(fēn)析。在此基礎上，我們還将使用(yòng)CAV-FLFxloxp-Flp等多(duō)種 Cre轉基因小(xiǎo)鼠，研究其交叉投射和細胞類型，從而實現對特定神經元群的調控。