組織免疫熒光技(jì )術

材料與儀器

材料：

1xPBS緩沖液（pH7.2~7.4）：NaCl 137 mmol/L, KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3 mmol/L, KH2PO41.4mmol/L。

CB：檸檬酸三鈉 3g, 檸檬酸 0.4g。

1% 鹽酸酒精(jīng)分(fēn)化液：按體(tǐ)積比為(wèi)濃鹽酸：無水乙醇 = 1:99 配制。

NGS：正常山(shān)羊血清，10% 及 1% NGS 用(yòng) 1xPBS 稀釋。

一抗、二抗按需選擇購(gòu)買，盡量參考高分(fēn)文(wén)獻，另可(kě)購(gòu)買抗熒光猝滅封片劑。

儀器：

烤片機、通風櫥、免疫組化染色缸或盒、微波爐、濕盒、熒光顯微鏡、微波爐。

步驟

• 一、加固定劑（按下述固定劑選擇固定條件，任選其一）：

10% 中(zhōng)性緩沖福爾馬林：在室溫下固定 10 min；

冷凍丙酮：-20℃ 冷凍 10 min，風幹；

甲醇：-20℃ 冷凍 10 min；

3% 甲醛：室溫下固定 15 min；

3% 甲醛/甲醇：在 3% 甲醛溶液中(zhōng)室溫固定 15 min，之後直接放入甲醇溶液中(zhōng) -20℃ 固定 5 min。 

二、1xPBS 清洗 2 次，每次 5 min。

1、選取質(zhì)量較好，厚度均勻的組織切片并做好标記，同時設立一張陰性對照切片；使用(yòng)不同抗體(tǐ)的切片盡量選取連續切片，避免因組織差别大而影響結果分(fēn)析的客觀性；

2、石蠟溶解：将切片置于 70℃ 原位雜交儀中(zhōng)，烤片 30 min (無烤片條件也可(kě)忽略此步直接進行(2)，适當增加脫蠟時間)；

3、脫蠟：将烤過後的切片迅速放入二甲苯中(zhōng)，2 次，各 5 min。

4、梯度水化：100%、90%、80%、70% 的乙醇中(zhōng)各放置 5 min，蒸餾水中(zhōng)放置 5 min；

5、内源性過氧化物(wù)酶阻斷：滴加 3% 過氧化氫，室溫于濕盒内放置 10  min 後，蒸餾水中(zhōng)放置 1 min；

6、抗原修複：放置于 1 x CB 中(zhōng)，微波爐 80% 火力 4 min，40% 火力  8 min，冷卻至室溫；

7、（可(kě)選步驟）0.3% Triton室溫通透 15 min；

8、封閉：吸幹組織周圍液體(tǐ)，滴加 10% NGS，放置于濕盒内，37℃ 30 min或室溫 2 小(xiǎo)時；

9、一抗：按抗體(tǐ)說明書建議比例使用(yòng) 1% NGS 稀釋抗體(tǐ)；吸幹組織周圍液體(tǐ)，滴加稀釋好的一抗，其中(zhōng)陰性對照組僅滴加 1% NGS，放置于濕盒内，37℃ 孵育 2 小(xiǎo)時，或 4 攝氏度過夜；

10、放置于 1xPBS 中(zhōng)清洗 3 次，每次 5 min；

11、二抗：吸幹組織周圍液體(tǐ)，加入稀釋好的熒光二抗，室溫避光孵育1h 後，1xPBS 洗三次，每次 5 min；

12、染核：加入 Hoechst 熒光染料标記細胞核，室溫孵育 15 min 後 1xPBS 洗兩次，每次 5 min；

13、封片：滴加一滴抗熒光猝滅封片劑于組織上，蓋玻片封片，置于顯微鏡下觀察拍照。