雙光子熒光成像(Two-Photon Fluorescence Imaging)

雙光子熒光顯微鏡(TPM)是激光掃描顯微鏡，局部激發基于雙光子吸收的熒光團。目前，TPM以其優異的穿透性和光學(xué)切片能(néng)力，成為(wèi)活體(tǐ)完整組織或活體(tǐ)動物(wù)亞細胞分(fēn)辨率下無創觀察細胞和器官結構和功能(néng)活動的有(yǒu)力工(gōng)具(jù)。

TPM已經在各種應用(yòng)中(zhōng)得到了應用(yòng)。神經科(kē)醫(yī)生使用(yòng)TPM來監測突觸、軸突、樹突、棘、神經活動和神經網絡。在不同的刺激下，如觸覺、食物(wù)、電(diàn)和視覺模式，動物(wù)的反應行為(wèi)伴随着功能(néng)性神經尖峰和結構變化[1-5]。因此，特定的行為(wèi)與特定的神經反應有(yǒu)關。這些聯系提供了重要的信息，可(kě)能(néng)表明神經系統如何處理(lǐ)來自外部世界的信息，并激活來自單個神經系統内部的命令。TPM作(zuò)為(wèi)神經科(kē)學(xué)的一種工(gōng)具(jù)，發揮着極其重要的作(zuò)用(yòng)。此外，采用(yòng)TPM觀察免疫效果。

1.雙光子吸收和雙光子顯微鏡

1929年，在哥(gē)廷根理(lǐ)論物(wù)理(lǐ)研究所，Maria Göppert-Mayer研究了兩個光子同時被一個分(fēn)子吸收的量子可(kě)能(néng)性[15]。然而，雙光子吸收的可(kě)能(néng)性極低，需要極高的峰值光強度來實現演示。直到1961年，Kaiser和Garrett在1960年5月Maiman發明激光後不久，才在實驗中(zhōng)首次實現了雙光子吸收[16]。1990年，Denk和Strickler和Webb将雙光子吸收與激光掃描共聚焦熒光顯微鏡相結合，具(jù)有(yǒu)前所未有(yǒu)的能(néng)力[17]。從那時起，配備了皮秒(miǎo)或飛秒(miǎo)脈沖、高功率激光器的雙光子顯微鏡已經成為(wèi)生物(wù)學(xué)和醫(yī)學(xué)領域三維高對比度、高分(fēn)辨率、快速成像的标準工(gōng)具(jù)。

圖1.雙光子激發和雙光子顯微鏡。(a)單光子激發示意圖和雙光子激發。(b)雙光子顯微鏡系統。(c) (a)單光子圖像熒光和雙光子熒光。(來源于文(wén)獻[18])

如圖1.a所示，一個熒光團分(fēn)子被一個光子激發到一個高能(néng)狀态。在這種狀态下停留很(hěn)短的時間後，通過非輻射弛豫，熒光團轉移到基态，并在納秒(miǎo)内發射熒光光子。由于弛豫能(néng)的損失，激發光子的能(néng)量大于發射光子;換句話說，激發光的波長(cháng)比發射光的波長(cháng)短。對于單光子激發，發射熒光的強度與激發激光的強度成線(xiàn)性正比。

如果一個光子的能(néng)量不足以将熒光團激發到激發态，則不會發生激發和發射。然而，如果兩個光子的能(néng)量足夠，則可(kě)能(néng)發生激發。為(wèi)了更容易理(lǐ)解，我們可(kě)以假設一個功率不足的光子将熒光團推到持續很(hěn)短時間的虛狀态。在此期間，如果該虛态熒光團遇到另一個功率不足的光子，并且這兩個光子的能(néng)量足以激發，則可(kě)能(néng)發生激發，如圖1.a所示。對于雙光子激發，發射熒光的強度與激發激光強度的平方成正比。不同分(fēn)子的雙光子激發概率用(yòng)橫截面表示，單位為(wèi)GM (Göppert-Mayer)或10 x 50 cm4 s/光子。例如，EGFP (Clontech)在927 nm波長(cháng)下的雙光子激發截面約等于39 x 10 x 50 cm4 s/光子。由于這種極低的概率，雙光子吸收是罕見的，很(hěn)難觀察到。為(wèi)了提高雙光子吸收，一種方法是使用(yòng)具(jù)有(yǒu)更高雙光子橫截面和适當波長(cháng)的明亮标記進行照明。另一種方法是在空間和時間上聚焦激光，形成更密集的光子通量。實際上，高na(數值孔徑)物(wù)鏡用(yòng)于緊聚焦激光，以在空間上增加光子密度。同時，脈沖激光被用(yòng)來暫時增加光子的密度。

一個典型的雙光子顯微鏡系統如圖1.b所示，由Ti:藍寶石激光器、galgal反光鏡、物(wù)鏡和光電(diàn)倍增管(PMT)組成。脈沖激光光斑被樣品平面上的反射鏡掃描，熒光被收集，然後由于其靈敏度投射到PMT上。然後，将PMT記錄的信号重新(xīn)組織成時間序列，形成圖像。例如，由于其穩定性和靈活性，将重複頻率為(wèi)80 MHz，脈沖持續時間為(wèi)~100 fs，平均功率為(wèi)50 mW的鎖模Ti:藍寶石激光器用(yòng)于雙光子顯微鏡，該激光器由532 nm的激光器泵浦，産(chǎn)生700-1300 nm的脈沖激光。掃描儀，通常是一個兩軸galvom鏡或聲光偏轉器(AOD)，将激光光斑重定向到标本平面上的不同橫向位置。對于體(tǐ)成像，需要軸向掃描機制，通常使用(yòng)壓電(diàn)、電(diàn)可(kě)調透鏡(ETL)、空間光調制器(SLM)、可(kě)調聲學(xué)梯度折射率透鏡(TAG)或遠(yuǎn)程聚焦。有(yǒu)不同的掃描策略，如逐行掃描或逐目标掃描。最常用(yòng)的逐行掃描以有(yǒu)限的成像速度産(chǎn)生足夠的采樣。高速逐目标成像僅掃描先前對大腦區(qū)域掃描确定的一些固定位置，以定位單個神經元[19]。

由于雙光子熒光的稀缺性，雙光子顯微鏡中(zhōng)的檢測器必須具(jù)有(yǒu)很(hěn)高的靈敏度。pmt和雪(xuě)崩光電(diàn)二極管(apd)在低光子探測中(zhōng)得到了廣泛的應用(yòng)。PMT使用(yòng)多(duō)個外部放大器，以近1ns的短響應時間将一個電(diàn)子提升到數百萬個。TPM的一個優點是光學(xué)切片能(néng)力。如上所示，雙光子吸收是困難的，隻有(yǒu)靠近激光焦點的區(qū)域才有(yǒu)足夠的光子進行有(yǒu)效的雙光子激發，因此收集到的熒光隻來自于如圖1.c所示的焦點區(qū)域。因此，在遠(yuǎn)離焦點的區(qū)域沒有(yǒu)足夠的TPM激發，從而導緻較少的光漂白和光毒性。這種光學(xué)切片能(néng)力非常類似于在單光子共聚焦顯微鏡，但源于雙光子激發沒有(yǒu)針孔。TPM具(jù)有(yǒu)光學(xué)切片能(néng)力，在一般情況下提供高信噪比的圖像，對比度令人滿意。

TPM的另一個優點是它對樣品的滲透深度長(cháng)。事實上，不均勻的生物(wù)組織散射光，導緻退化的約束激發光子密度和成像對比度。在散射中(zhōng)占主導地位的瑞利散射與波長(cháng)成反比，TPM中(zhōng)使用(yòng)的紅外光的波長(cháng)比傳統的單光子顯微鏡(如共聚焦顯微鏡)中(zhōng)使用(yòng)的可(kě)見光的波長(cháng)長(cháng)。此外，與單光子成像相比，雙光子成像中(zhōng)波長(cháng)較長(cháng)的激發光被生物(wù)組織的主要成分(fēn)水吸收較少。這兩大特性使得TPM中(zhōng)的紅外光激發更深。這種特性對于需要深穿透深度的應用(yòng)至關重要。

因此，TPM特别适用(yòng)于活體(tǐ)和原位深部埋深、分(fēn)布較厚的組織的成像目标，如皮層下神經元的成像。此外，由于光效率的關系，光漂白和光毒性不是光子預算的主要考慮因素。但是，應考慮線(xiàn)性吸收引起的熱損傷。據報道，平均功率的安(ān)全限制為(wèi)2-5 mW/μm2，脈沖能(néng)量密度的安(ān)全限制為(wèi)0.025-0.06 nJ/μm²。

圖2.基于TPM的ao輔助共聚焦和TPM。(a)的雙色共聚焦成像少突膠質(zhì)細胞(洋紅色)和神經元核(綠色)(來源于參考文(wén)獻23)。(b) TPM三維圖像堆棧和不同深度的圖像來自于體(tǐ)積為(wèi)810μm³的體(tǐ)内神經元成像vS1皮質(zhì)與系統AO和完全AO校正。(來源于參考文(wén)獻26)

在神經科(kē)學(xué)中(zhōng)，視覺刺激，例如旋轉光栅圖案，虛拟現實場景或LED信号，對于發現行為(wèi)與神經元反應之間的聯系和關系至關重要。然而，包括斑馬魚在内的大多(duō)數動物(wù)在單光子顯微鏡下都能(néng)看到光源，這就提出了一個問題，即神經元是對視覺刺激模式做出反應，還是僅僅對單光子激光激發源做出反應。相比之下，在雙光子顯微鏡下，紅外光源是不可(kě)見的，這就排除了光源幹涉的可(kě)能(néng)性。

由于存在不均勻的折射率和組織散射，激發光經常發生畸變，難以有(yǒu)效聚焦。扭曲的點擴展函數(PSF)降低了光子強度，導緻信号急劇下降，直到信号在一定深度完全淹沒在噪聲中(zhōng)。自适應光學(xué)(AO)系統通常用(yòng)于處理(lǐ)這種情況。在檢索或重建樣品誘導的波前後，通過使用(yòng)有(yǒu)源光學(xué)元件(如空間光調制器或可(kě)變形鏡)在系統中(zhōng)施加補償波前來抵消攝動[22-25]。此外，雙光子激發熒光還可(kě)以作(zuò)為(wèi)另一種成像模型的指導，如圖2.a, b所示。2018年，Janelia Research Campus的Betzig小(xiǎo)組[26]報道了一種結合點陣光片和基于tpm的AO的系統。将TPM的熒光發送到Shack-Hartmann波前傳感器重建局部區(qū)域的波前，并對激發和發射路徑進行補償，充分(fēn)挖掘晶格光片的功率。

圖3.空間和時間聚焦和複雜。(a)基于雕刻PSF技(jì )術的時間聚焦示意圖，激光束撞擊光栅、物(wù)鏡的後焦平面和焦平面的時空截面剖面圖。(b)使用(yòng)微透鏡陣列的多(duō)焦點空間複合。(c)多(duō)脈沖時間複合。(d)基于衍射受限psf的采樣和基于雕刻psf的采樣的比較。(來源于參考文(wén)獻28)

2. 圖像采集速度

掃描顯微鏡的一個主要缺點是成像速度的限制。通過使用(yòng)掃描裝(zhuāng)置，例如galgal鏡，激光焦點在整個視場中(zhōng)逐點移動感興趣區(qū)域(ROI)。為(wèi)了獲得可(kě)接受的熒光強度，探測器的積分(fēn)時間應該足夠長(cháng)，以接收多(duō)個熒光光子。通常，當使用(yòng)重複頻率為(wèi)80 MHz的激光源時，TPM産(chǎn)生12 MHz的有(yǒu)效像素率;換句話說，幾乎5-6個脈沖的熒光産(chǎn)生一個像素。

近幾十年來，已經開發了許多(duō)技(jì )術來解決這個問題。2005年，康奈爾大學(xué)的Chris Xu小(xiǎo)組[27]報道了空間和時間聚焦(TeFo)技(jì )術，以減少背景以獲得更好的穿透。一個光學(xué)光栅被用(yòng)來形成“彩虹”光束，平行光束按波長(cháng)線(xiàn)性位移。每個光譜分(fēn)量都是空間聚焦的，但不是很(hěn)好地重疊，這增加了光子的軸向限制。TeFo提供了一個示例來說明如何在空間和時間上調制PSF。

基于TeFo, 2016年洛克菲勒大學(xué)的Vaziri小(xiǎo)組[28]通過雕刻PSF技(jì )術演示了單脈沖每體(tǐ)素激發(圖3. d)，以單細胞分(fēn)辨率實現了快速體(tǐ)積速率和大體(tǐ)積(3-6 Hz, 0.5 x  0.5 x  0.5 mm³)。利用(yòng)TeFo(雕刻型PSF ~5 x 5 x 10μm³，高斯型PSF ~5 x 5 x 70μm³)對PSF進行軸向約束和側向擴展，以激發最小(xiǎo)體(tǐ)素并解析目标，如圖3.3a所示。注意，在這種情況下，激光的重複頻率相對較低(4.1 MHz)，以增加一個脈沖中(zhōng)的光子通量。通過稍微降低空間分(fēn)辨率，雕刻的PSF為(wèi)快速、大體(tǐ)積成像提供了一個概念框架。

1998年，Stefan Hell小(xiǎo)組[29]繪制了第一張用(yòng)于多(duō)光子顯微鏡的空間複用(yòng)示意圖。如圖3.b所示，利用(yòng)旋轉的微透鏡盤對激光進行空間分(fēn)離，形成多(duō)焦激勵，使成像速度提高40 - 100倍。然而，單個焦點的能(néng)量急劇下降，這對信噪比和穿透都是有(yǒu)害的。2007年，W. Amir等人[30]提出了一種時間多(duō)重多(duō)光子顯微鏡。兩個激光源由兩個相互放置的脈沖序列組成，這些脈沖序列指向樣品的不同平面，通過對記錄的信号進行解複用(yòng)得到實際分(fēn)布。這種方法提供了脈沖可(kě)以重新(xīn)排序和分(fēn)離的概念(圖3.c)。Vaziri團隊在2019年通過結合時空複用(yòng)、PSF雕刻和遠(yuǎn)程掃描技(jì )術達到了一個裏程碑[31]。一方面，利用(yòng)光栅對光按波長(cháng)進行故意分(fēn)散，形成軸向受限、橫向擴展的點擴展函數;然後，通過減少橫向采樣來提高成像速度。成功實現PSF雕刻的關鍵是使用(yòng)低重複率激光和PSF軸向限制，以确保足夠的光子強度。另一方面，将脈沖分(fēn)成多(duō)個光路以獲得不同的時間延遲，然後通過定制的鏡子沿不同的空間方向定向。時空複用(yòng)為(wèi)特定的成像需求提供了靈活的配置。通過結合雙光子/三光子顯微鏡中(zhōng)的PSF雕刻和時空複用(yòng)，這種混合策略(HyMS)構建了一個集成的概念框架，以适應單細胞分(fēn)辨率的高速(16.7 Hz, 0.69 x 0.675 x 0.6 mm³,TPM)和大容量(5.1 Hz, 1 x 1 x 0.6 mm³,TPM)成像采集的需求。在這種情況下，空間分(fēn)辨率為(wèi)更高的成像速度和更大的體(tǐ)積尺度而受到損害，但仍然足以解決單個神經元。HyMS的像素采集速度接近PMT極限，像素在ROI内分(fēn)布規律。神經元在大腦皮層中(zhōng)隻占據很(hěn)小(xiǎo)的空間，一些采樣像素不提供神經元信号。因此，在神經科(kē)學(xué)中(zhōng)發展了獨特的技(jì )術。通常，三維随機存取多(duō)光子熒光顯微鏡(RAMP)[32]充分(fēn)利用(yòng)了先前的生物(wù)學(xué)知識。RAMP使用(yòng)激光聚焦光栅掃描一個神經元，然後将激光焦點重定向到另一個神經元進行掃描，如圖4.a所示。随後，在2019年，Chris Xu小(xiǎo)組提出了一種自适應激發源(AES)，該激發源可(kě)以使激光焦點在空白區(qū)域被抑制，并在神經元區(qū)域出現[19]，如圖4.b所示。利用(yòng)之前的全栅格掃描測量得到神經元的占用(yòng)區(qū)域及其ROI信息。與常規方案相比，激光阻斷策略大大降低了平均功率，這對于減少熱損傷的縱向神經成像至關重要。具(jù)體(tǐ)來說，每個神經元的平均光子數高出7倍，而平均功率幾乎降低了4.5倍(30 Hz, 0.7 x 0.7 mm², 18 mW, TPM)。RAMP與AES的結合可(kě)進一步提高成像速度和效率。

圖4.條件必選快速TPM。(a)三維随機存取多(duō)光子自定義掃描光子顯微鏡(來源于參考文(wén)獻1)。(b)清醒小(xiǎo)鼠硬腦膜下750μm神經元結構圖像的TPM比較(無自适應激勵源和有(yǒu)自适應激勵源時相同位置的TPM)。比例尺，100μm(來源于參考文(wén)獻19)。(c)清醒小(xiǎo)鼠具(jù)有(yǒu)突觸分(fēn)辨率的體(tǐ)積功能(néng)成像神經元中(zhōng)高斯和貝塞爾模塊的最大強度投影(來源于參考文(wén)獻33)。(d) faces将脈沖光片重塑為(wèi)空間分(fēn)離和時間延遲的焦點x和z方向分(fēn)辨率略有(yǒu)降低的物(wù)鏡焦平面(來源于參考文(wén)獻34)。(e)不同成像采集速度和視場的TPM成像參數優化示例。(來源于參考文(wén)獻35)

最近，香港大學(xué)的Tsia小(xiǎo)組和加州大學(xué)伯克利分(fēn)校的Ji小(xiǎo)組共同努力，報道了前所未有(yǒu)的超快TPM[34]。一個由一對幾乎平行的鏡子組成的模塊，稱為(wèi)自由空間角啁啾增強延遲(faces)，用(yòng)于将一個光脈沖分(fēn)成80個脈沖，這些脈沖在時間和空間上分(fēn)離，從而實現水平圖像采樣，如圖4.d所示。然後，使用(yòng)另一個galvom反鏡進行垂直采樣，這意味着該galvom反鏡的速度決定了圖像采集速度。使用(yòng)FACED-TPM，神經元成像已觀察到高達3000 Hz (80 x 1200像素，50 x 250μm²)，這足以監測一些瞬态活動。在這種情況下，像素采集率達到了PMT硬件的限制。

對于大體(tǐ)積成像，例如中(zhōng)尺度成像，成像速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)落後于要求。最近，Ji組将貝塞爾光束模塊和介觀鏡結合起來進行稀疏标記神經元成像，避免了軸向掃描，速度提高了幾十倍[33]，如圖4.c所示。貝塞爾光束模塊将高斯焦點重塑為(wèi)貝塞爾焦點，并具(jù)有(yǒu)細長(cháng)的軸向分(fēn)布。與高斯聚焦掃描策略(0.06 Hz, 307幅圖像，301x 405 x 612μm³)不同，貝塞爾焦點橫向掃描(3.2 Hz, 6幅圖像，301 x 405 x 612μm³)的熒光提供了軸向延伸的信息，而不需要實際的物(wù)理(lǐ)軸向掃描。貝塞爾光束的核心比高斯光束的核心小(xiǎo)，橫向分(fēn)辨率優于高斯光束。由于貝塞爾光束軸向延長(cháng)，光子密度降低，圖像信背景比(SNR)降低，穿透深度可(kě)能(néng)成為(wèi)一個問題。

3. 采集的視野體(tǐ)積

由于采用(yòng)TPM的掃描形式，可(kě)以實現體(tǐ)積視場和成像速度很(hěn)容易相互交換不同的掃描模式。如從圖4.e可(kě)以看出，大視場掃描時，激光聚焦的移動需要更多(duō)的時間。演示了針對不同應用(yòng)優化參數的TPM卡雷爾·斯沃博達在珍妮利亞研究校園報道。例如，用(yòng)TPM映像1024 x 1024像素，面積0.6 x 0.6 mm²，像素大小(xiǎo)0.6 x 0.6μm²幀率為(wèi)21，而成像由七個條紋組成，每個條紋有(yǒu)1750 x 1750像素，4.4 x 4.2 mm²面積，2.4 x 2.6μm²像素尺寸幀率為(wèi)1.9[35]。對于成像堆棧，TPM具(jù)有(yǒu)752 x 1125 x 307像素，a0.301 x 0.45 x 0.612 mm³的面積，而一個0.4 x 0.4 x 2μm³的像素大小(xiǎo)将隻有(yǒu)一個幀率為(wèi)0.06[33]。

4. 采集的深度

如上所述，TPM具(jù)有(yǒu)良好的深度滲透性。一般用(yòng)于小(xiǎo)鼠腦成像的TPM深度約為(wèi)0.6-0.7 mm，信噪比較好[19,31,33]。配備AO系統的先進TPM實現了近衍射限制。如圖2.c所示[25]。Masashi Kondo等[36]在TPM中(zhōng)使用(yòng)波長(cháng)較長(cháng)的激光源紅色指示器，對1.2 mm以内的前額皮質(zhì)和海馬進行功能(néng)性成像，其散射和吸收較少。更長(cháng)的穿透(1.2 mm)與綠色指示将需要波長(cháng)更長(cháng)的三光子激發[31,37]。

5.結論及未來展望

（1）根據不同的生物(wù)學(xué)應用(yòng)，雙光子顯微鏡的空間、時間、成像深度和視場分(fēn)别有(yǒu)不同的發展方向。

（2）微型雙光子顯微鏡提出了實現自由行為(wèi)動物(wù)的高分(fēn)辨率成像的最新(xīn)前沿。

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