活體(tǐ)顱骨光透明技(jì )術在光學(xué)成像中(zhōng)的應用(yòng)
活體(tǐ)腦成像對于研究大腦生理(lǐ)病理(lǐ)活動有(yǒu)着至關重要的意義。現代光學(xué)成像技(jì )術侵入性低、分(fēn)辨率高，因而能(néng)夠用(yòng)于活體(tǐ)觀測生物(wù)結構和功能(néng)，在腦科(kē)學(xué)領域發揮着重要作(zuò)用(yòng)。但是，在活體(tǐ)狀态下，大腦有(yǒu)顱骨覆蓋，而顱骨對光的強散射和像差嚴重限制了光的穿透深度，進而影響了皮層成像的分(fēn)辨率和深度。為(wèi)了克服顱骨的散射，以往的研究往往需要在成像前建立各類手術顱窗，主要包括開顱玻璃窗、磨薄顱骨窗以及它們的變體(tǐ)。
磨薄顱骨窗的建立通過将部分(fēn)顱骨磨薄至約 25 μm左右，從而實現對皮層的活體(tǐ)高分(fēn)辨觀測。但磨薄顱骨窗不适用(yòng)于大視場觀測皮層，因為(wèi)将大面積的顱骨均勻地磨薄至25 μm的難度非常大。另外，顱骨被磨薄後會重新(xīn)生長(cháng)，并且新(xīn)生的顱骨易碎，難以實現多(duō)次的重複打磨。所以，磨薄顱骨窗不适用(yòng)于長(cháng)期跟蹤觀測。開顱手術容易導緻炎症反應及氧化應激反應，進而開顱後3天逐漸形成白色絮狀物(wù)影響後續成像效果，且往往會持續約 2周，因此并不适合急性模型（3天以内）的觀測及長(cháng)期（2周以上）活體(tǐ)成像監測。
近些年興起的組織光透明技(jì )術可(kě)以降低生物(wù)組織的散射，增強光在組織中(zhōng)的穿透能(néng)力，已被廣泛應用(yòng)于離體(tǐ)大組織甚至全器官三維高分(fēn)辨成像。不僅如此，組織光透明技(jì )術在活體(tǐ)水平也得到了很(hěn)好的應用(yòng)。研究人員發展的活體(tǐ)顱骨光透明技(jì )術，以及基于此建立的光透明顱窗，可(kě)以在不進行開顱手術的情況下，結合多(duō)種現代光學(xué)成像手段，實現大腦皮層的神經血管結構和功能(néng)的無創成像觀測。針對不同的應用(yòng)場景，開發了不同的光透明顱窗，可(kě)以分(fēn)别滿足高分(fēn)辨、大視場、長(cháng)時程觀測等要求。相比于開顱玻璃窗，光透明顱窗可(kě)以避免手術帶來的炎症反應等副作(zuò)用(yòng)，從而适用(yòng)于急性觀測；而相比于磨薄顱骨窗，光透明顱窗可(kě)以通過反複操作(zuò)而觀測數月，從而實現長(cháng)期跟蹤監測。
目前的活體(tǐ)顱骨光透明方法包括以下幾種：（1）SOCS:實現活體(tǐ)顱骨光透明[1]；（2）SOCW:實現穿顱神經樹突棘成像[2]；（3）USOCA:可(kě)開合的大視場顱窗[3]；（4）VNSOCA:可(kě)見-近紅外兼容的光透明顱窗[4]；（5）用(yòng)于長(cháng)期觀測的光透明顱骨窗（TIS）[5]。本文(wén)主要介紹活體(tǐ)顱骨光透明技(jì )術在光學(xué)成像中(zhōng)的應用(yòng)。
（1）激光散斑襯比/高光譜成像
激光散斑血流成像系統采用(yòng)激光散斑技(jì )術，可(kě)以對組織血流進行連續監測，具(jù)有(yǒu)非接觸、無創傷、快速成像等優點，可(kě)用(yòng)于記錄由于皮膚營養和體(tǐ)溫調節等因素引起的毛細血管、微靜脈和微動脈中(zhōng)的血流變化；高光譜成像技(jì )術是一種非标記的血氧分(fēn)布成像技(jì )術。顱骨光透明技(jì )術的出現使其得以在完整顱骨下獲取皮層血流及血氧信息。
圖1. 重複光透明成像用(yòng)于皮層血流和血氧監測[3]。（a）顱骨短期重複透明成像；（b）顱骨長(cháng)期重複透明成像。
圖2. 光透明顱窗用(yòng)于監測MCAO引起的皮層血流動力學(xué)變化[3]。（a）MCAO前後雙側皮層血流及血氧變化；（b-c）皮層血流及血氧變化柱狀圖。
（2）光聲成像
研究人員将活體(tǐ)皮膚光透明試劑注射到小(xiǎo)鼠皮下後，對皮下血管進行光聲成像。結果表明：在所有(yǒu)檢測頻率下，光聲信号都顯著升高，極大地改善了小(xiǎo)血管和大血管的可(kě)視化，定量分(fēn)析結果顯示皮下血管造影深度增加了3~4倍（圖3a）。此外，研究人員還将活體(tǐ)皮膚光透明試劑與超聲凝膠混合後塗抹在小(xiǎo)鼠皮膚表面，作(zuò)為(wèi)耦合劑使用(yòng)。結果發現在試劑作(zuò)用(yòng)後，皮膚略微透明，大、小(xiǎo)血管的可(kě)視化都得到了改善，并且光聲成像深度顯著增加，血管造影深度提高1.5~2倍（圖3b）。
圖3. 活體(tǐ)皮膚光透明用(yòng)于光聲成像獲取小(xiǎo)鼠皮下血管結構[4]。（a）小(xiǎo)鼠皮下注射活體(tǐ)皮膚光透明試劑後，血管光聲成像改善效果。（b）小(xiǎo)鼠皮膚塗抹活體(tǐ)皮膚光透明試劑後，血管光聲成像改善效果。
（3）受激拉曼成像
圖3. 受激拉曼成像揭示顱骨光透明技(jì )術的機制[7]。（a-c）幼年小(xiǎo)鼠頂骨中(zhōng)膠原纖維和羟基磷灰石顯微結構圖像。顱骨未處理(lǐ)（a），10 %膠原酶處理(lǐ)（b），10 % EDTA處理(lǐ)（c）。（d-f）成年小(xiǎo)鼠頂骨中(zhōng)膠原纖維和羟基磷灰石的微觀結構變化。顱骨未處理(lǐ)（d）， USOCA處理(lǐ)（e），10 % EDTA處理(lǐ)（f）。
（4）雙光子/三光子成像
如圖4所示，活體(tǐ)皮膚光透明技(jì )術能(néng)夠顯著提升皮下免疫細胞雙光子成像的效果。一方面，雙光子成像獲取的圖像信号強度和信噪比都顯著提高；另一方面，活體(tǐ)雙光子成像的深度也得到極大提升（2~3倍）。
借助活體(tǐ)皮膚光透明技(jì )術，研究人員還研究了糖尿病對小(xiǎo)鼠皮膚免疫功能(néng)的影響。在糖尿病小(xiǎo)鼠足墊誘發延遲型超敏反應（DTH）後，通過雙光子成像觀察單核/巨噬細胞在不同時間點的響應。結果發現糖尿病小(xiǎo)鼠DTH後單核/巨噬細胞的浸潤和募集增加，但其運動能(néng)力明顯減弱，說明單核/巨噬細胞免疫功能(néng)異常，并且其功能(néng)異常随着糖尿病的進展而進一步增強（圖5）。通過體(tǐ)内皮膚光透明提高光學(xué)成像深度，可(kě)以比較炎症部位周圍不同深度的單核/巨噬細胞的運動行為(wèi)。對于正常小(xiǎo)鼠來說，在DTH早期（DTH-4 h）皮膚深層單核/巨噬細胞的遷移距離明顯大于淺層，而在DTH晚期（DTH-72 h）則相反，說明不同深度的皮膚免疫反應存在差異。
圖6. 光透明顱窗用(yòng)于三光子成像[4, 5]。（a-c）顱骨光透明作(zuò)用(yòng)前後皮層血管白光圖（a）、三次諧波信号（b）、神經元信号三維重構（c）。
（5）光操控
圖7. 顱骨光透明技(jì )術用(yòng)于皮層光操控[8, 9]。（a）光透明顱窗結合光動力效應打開血腦屏障；（b）光透明顱窗結合光動力效應實現光栓模型建立。
活體(tǐ)顱骨光透明技(jì )術已經應用(yòng)于多(duō)個領域，如神經血管成像、皮層光操控、建立特定的疾病模型等，為(wèi)活體(tǐ)皮層觀測提供了一個無需開顱的光學(xué)窗口。不同的腦科(kē)學(xué)研究對顱窗提出了不同的要求。比如，神經突觸成像需要高分(fēn)辨觀測，許多(duō)疾病的研究需要長(cháng)時程跟蹤，急性病理(lǐ)模型需要建窗口立即觀測，神經功能(néng)成像需要在清醒動物(wù)上開展，跨腦區(qū)研究需要較大的觀測視場。而光透明顱窗發展至今，已同時具(jù)備了高分(fēn)辨、大視場、長(cháng)時程、适用(yòng)于急性觀測的優勢，因而有(yǒu)望在某些傳統顱窗無法勝任的場合（比如急性創傷性腦損傷的跨腦區(qū)觀測）提供重要的技(jì )術支撐，從而在未來的腦科(kē)學(xué)研究中(zhōng)大放異彩。但是，仍舊要意識到目前顱骨光透明技(jì )術依然有(yǒu)所限制。比如，目前尚未有(yǒu)适用(yòng)于更大動物(wù)（比如大鼠、猕猴等）的活體(tǐ)顱骨光透明方法，這需要研究人員繼續探索更高效的顱骨光透明方法。未來更好的顱骨光透明的出現，結合更多(duō)的成像方法，會為(wèi)腦科(kē)學(xué)的發展提供更有(yǒu)力的技(jì )術保障。
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