5分(fēn)鍾了解\\什麽是慢病毒？它有(yǒu)哪些應用(yòng)？

慢病毒包裝(zhuāng)的實驗步驟：

（1）構建含有(yǒu)目的基因的慢病毒載體(tǐ)。

（2）大量擴增慢病毒載體(tǐ)：根據實驗将包裝(zhuāng)慢病毒過程中(zhōng)需要用(yòng)到的3個質(zhì)粒進行高純度無内毒素抽提。

（3）293T細胞内進行慢病毒載體(tǐ)的大量包裝(zhuāng)：按一定比例将轉移質(zhì)粒、包裝(zhuāng)質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒共轉染指數生長(cháng)期的293T細胞。

（4）慢病毒的濃縮及純化：PEG8000濃縮法/蔗糖密度梯度超速離心法。

（5）慢病毒滴度測定：采用(yòng)GFP熒光計數、絕對定量qPCR和RT-qPCR等進行慢病毒滴度測定。圖 293T細胞慢病毒包裝(zhuāng)過程（E Martínez-Molina et al., 2020）。

慢病毒包裝(zhuāng)過程中(zhōng)的常見問題：

1、如何計算需要加入的病毒量？

通過MOI計算。MOI（Multiplicity of Infection，感染複數）是指每個細胞感染的病毒數，通常MOI越高，病毒整合到染色體(tǐ)的數量以及目的蛋白的表達量越高，證明細胞越難被感染。一般我們把某株細胞有(yǒu)80%被感染時所用(yòng)的病毒顆粒數和細胞數目的比值作(zuò)為(wèi)該株細胞的MOI。

相關計算公(gōng)式：

每孔所加病毒量（μL）=MOI×細胞數/病毒滴度（TU/mL）×1000

MOI=（病毒滴度×病毒體(tǐ)積）/細胞數目

病毒滴度可(kě)通過熒光計數法進行确定。
2、慢病毒感染細胞，鋪闆密度是多(duō)少？

通常根據細胞增殖的速度調整細胞鋪闆密度，以保證在感染後3天左右細胞剛好快長(cháng)滿培養皿底部為(wèi)宜。

針對大部分(fēn)細胞系：傳代周期在2~3天，感染時細胞鋪闆的密度保持在30~50%左右；

針對某些原代細胞：由于細胞增長(cháng)緩慢，可(kě)以在接種時提高彙合度到70~80%左右；

針對非分(fēn)裂細胞：如神經元細胞，接種後不再增殖，此時可(kě)以按照100%的彙合度進行接種。

3、向細胞中(zhōng)加入慢病毒的最佳時間是什麽時候？

一般慢病毒感染細胞後可(kě)在2~3天觀察到所攜帶基因的熒光表達情況，即在細胞狀态良好，彙合度為(wèi)30~50%時加入慢病毒，以确保在感染後2天時細胞增長(cháng)達到70%左右的彙合度，即是最佳時間。

4、慢病毒感染細胞後基因表達多(duō)久到達峰值？

慢病毒感染後大部分(fēn)細胞GFP或目的基因的表達在3天左右達到峰值，但若是細胞生長(cháng)緩慢，達到峰值的時間就會延長(cháng)。

5、慢病毒感染細胞後為(wèi)什麽GFP熒光信号弱？

一般與進入宿主細胞内慢病毒顆粒數較少、自身的增殖狀态較差、細胞種類、觀察時間較早、目的基因表達或者特殊結構等因素有(yǒu)關。一般慢病毒感染細胞3天左右熒光信号最強。

6、慢病毒包裝(zhuāng)出毒量很(hěn)低？

可(kě)能(néng)與以下幾個方面有(yǒu)關：

（1）細胞狀态：一般293T細胞的活力、增殖狀态、鋪闆密度、是否處于對數生長(cháng)期等對病毒的産(chǎn)量影響很(hěn)大。

（2）質(zhì)粒提取的質(zhì)量：若出現純度不高、濃度過低、未去除内毒素、目的基因載體(tǐ)構建的不完整等均會導緻包裝(zhuāng)出毒量很(hěn)低。

（3）目的基因：目的基因的片段大小(xiǎo)、序列及翻譯的蛋白是否含有(yǒu)毒性均會影響包裝(zhuāng)效果。目的基因片段過大（＞2.5k）可(kě)能(néng)會導緻包裝(zhuāng)滴度下降，甚至無法包裝(zhuāng)。目的基因翻譯的蛋白産(chǎn)生細胞毒性，可(kě)能(néng)會導緻細胞增殖異常以至于包裝(zhuāng)出毒量很(hěn)低。

（4）收毒時間：收毒時間過早，會導緻出毒量很(hěn)低。一般在轉染後24h觀察細胞生長(cháng)狀态和熒光信号強弱，若細胞生長(cháng)狀态良好，第一次可(kě)在48h收集病毒上清，第二次可(kě)在換液後72h收集病毒上清。

7、慢病毒感染細胞效率低？

可(kě)能(néng)與以下因素有(yǒu)關：

（1）細胞類型：某些原代細胞和幹細胞自身較難轉染，導緻慢病毒感染細胞效率低，可(kě)加大病毒量或采用(yòng)濃縮病毒進行感染。

（2）細胞生長(cháng)狀态：細胞感染前生長(cháng)狀态異常，如存在支原體(tǐ)污染、細胞鋪闆密度過大等。

（3）病毒質(zhì)量：慢病毒滴度不高，操作(zuò)時應盡量避免凍融，建議分(fēn)裝(zhuāng)儲存。

應用(yòng)案例：

圖：慢病毒被注射到正确的位置（黑質(zhì)）。（A）黑質(zhì)中(zhōng) TH 陽性神經元（紅色标記）的免疫熒光。（B）RAGE-siRAGE 慢病毒載體(tǐ)（綠色标記）和 TH 神經元的合并圖像黑質(zhì)（放大倍數：100×）PMID: 32410941

圖：KLF2增強bEnd.3細胞中(zhōng)的自噬溶酶體(tǐ)途徑。分(fēn)别用(yòng)慢病毒-Klf2或慢病毒-Klf2 shRNA轉染bEnd.3細胞以過表達或敲低KLF2表達。(A) 慢病毒-Klf2 轉染的 bEnd.3 細胞中(zhōng)自噬溶酶體(tǐ)通路标記物(wù)（LC3、p62、CTSD 和 LAMP2）的蛋白質(zhì)印迹和定量。 (BC) 用(yòng)慢病毒-Klf2 轉染的 bEnd.3 細胞中(zhōng) MDC (B) 和 Lyso-Tracker (C) 染色的代表性圖像和量化。 (D) 用(yòng)慢病毒-Klf2 轉染的 bEnd.3 細胞中(zhōng) LC3 和 LAMP1 的代表性免疫熒光圖像和定量。 (E) 用(yòng)慢病毒-Klf2 shRNA 轉染的 bEnd.3 細胞中(zhōng)自噬溶酶體(tǐ)通路标記物(wù)（LC3、p62、CTSD 和 LAMP2）的蛋白質(zhì)印迹和定量。 (FG) 用(yòng)慢病毒-Klf2 shRNA 轉染的 bEnd.3 細胞中(zhōng) MDC (F) 和 Lyso-Tracker (G) 染色的代表性圖像和量化。 (H) 用(yòng)慢病毒-Klf2 shRNA 轉染的 bEnd.3 細胞中(zhōng) LC3 和 LAMP1 的代表性免疫熒光圖像和定量。 PMID: 35530152

圖：TM 細胞中(zhōng)多(duō)功能(néng)蛋白聚糖的慢病毒 shRNA 沉默。(A) 将指定稀釋度的多(duō)功能(néng)蛋白聚糖 shRNA 慢病毒添加到培養的豬和人 TM 細胞中(zhōng)，并在 48 小(xiǎo)時後通過 qRT-PCR 評估多(duō)功能(néng)蛋白聚糖 mRNA。值表示相對于模拟感染的 TM 細胞的比率。(B–G) 豬 (B–D) 和人 (E–G) TM 細胞在培養物(wù)中(zhōng)的免疫熒光，使用(yòng)針對 (B,E) 模拟感染細胞的多(duō)功能(néng)單克隆抗體(tǐ)，(C,F) 對照慢病毒感染細胞和 (D,G) versican shRNA 慢病毒感染細胞。感染後 72 小(xiǎo)時進行免疫熒光。PMID: 21596823

圖：PHLDA1 抑制 AKT 的磷酸化。(A) 顯示 PHLDA1 mRNA 結構的基因組浏覽器軌迹和 PHLDA1 蛋白結構的示意圖。(B,C) 免疫熒光染色顯示強 pAKT 表達很(hěn)少與 PHLDA1 表達共定位。(D,E) 轉染 shPHLDA1 的視網膜類器官中(zhōng) pAKT 的免疫熒光。與用(yòng) Scramble shRNA 轉染的細胞相比，PHLDA1 KD 的表達顯着增加。比例尺 = 20 µm。Arrowheadsindicate 由慢病毒 (mCherry+) 轉染的細胞。(F,G) 用(yòng)慢病毒轉染過表達 PHLDA1(OE) 的視網膜類器官中(zhōng) pAKT 的免疫熒光。比例尺 = 20 µm。Arrowheadsindicate 由慢病毒 (mCherry+) 轉染的細胞。(H, I) Y79 中(zhōng)具(jù)有(yǒu) PHLDA1 過表達 (OE) 的 pAKT 的蛋白質(zhì)印迹分(fēn)析。使用(yòng)FLAG抗體(tǐ)檢測外源性過表達的PHLDA1。(J, K) AKT 激活和抑制對光感受器分(fēn)化的影響。W12 視網膜類器官用(yòng) AKT 激動劑 SC79（SC，10 µM）或拮抗劑 MK2206（MK，1 µM）處理(lǐ) 2 周。PMID: 36331259

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以上介紹了什麽是慢病毒？以及其在醫(yī)學(xué)科(kē)研中(zhōng)常用(yòng)的一些應用(yòng)實例，希望對大家有(yǒu)所幫助！